时间:2020-5-14来源:不详 作者:佚名 点击: 61 次
治疗白癜风什么方法好 http://m.39.net/pf/a_5818755.html

戚新明任进

中国科学院上海药物研究所,新药研究国家重点实验室,药物安全评价研究中心,上海

摘要目的通过考察仙灵骨葆对肝脏细胞线粒体功能来评价其是否有肝脏损伤作用。方法通过检测仙灵骨葆醇提液和水提液对大鼠原代肝脏细胞ATP含量,线粒体膜电位和线粒体特异荧光染料在线粒体内富集程度等线粒体功能和形态指标的影响,比较两种不同提取方法对肝脏线粒体的作用。结果仙灵骨葆醇提液在10~倍稀释的情况下肝细胞线粒体状态均有显著变化,而水提液则仅在稀释10倍和倍时线粒体状态才有明显改变。两者只有在稀释10倍(大约是临床剂量的50倍)时显著降低肝细胞ATP含量以及线粒体膜电位。结论仙灵骨葆两种提取方式中水提法与临床使用方式更为接近,这提示目前仙灵骨葆临床使用剂量有较宽的安全范围,而醇提法对肝细胞活力以及线粒体的形态和功能的影响明显强于水提法。

关键词仙灵骨葆;水提物;醇提物;药物性肝损伤;大鼠原代肝脏细胞;线粒体功能

两种仙灵骨葆提取液对肝脏线粒体的作用

戚新明任进

。。仙灵骨葆是由淫羊藿、补骨脂、续断、丹参、知母、地黄六味中草药组成的复方制剂,主要用于治疗骨质疏松、骨折、骨关节炎、骨无菌性坏死等[1]。仙灵骨葆的六味药物中的有效成分目前已有一些分析。其中,淫羊藿苷为淫羊藿的主要成分,也是淫羊藿药理活性的代表化合物;补骨脂素和异补骨脂素是补骨脂的主要活性成分;而续断的主要成分是川续断皂苷VI[2]。

。。临床研究显示,仙灵骨葆对骨质疏松的症状有明显的缓解作用,尤其是对骨质疏松引起的骨痛能够明显缓解,使用1个月后80%的患者已经没有明显的骨痛症状,两个月后所有患者的四肢抽筋的症状消失[3]。也有文献将例胸腰椎骨质疏松性骨折患者随机分为观察组和对照组,观察组口服仙灵骨葆胶囊,对照组口服阿仑膦酸钠联合碳酸钙D3,治疗6个月后发现观察组和对照组对骨密度和疼痛症状的改善效果相当,而不良反应的发生率观察组明显低于对照组,这说明仙灵骨葆对胸腰椎骨质疏松性骨折具有良好的临床疗效,且具有非常好的安全性[4]。另外也有报道将例骨性关节炎分为治疗组和对照组,结果发现治疗组在疼痛,晨僵,关节肿胀,患者总体评价等方面指标明显优于对照组,说明仙灵骨葆治疗骨性关节炎有明确疗效且不增加副作用,具有广泛的应用前景[5]。

。。目前,有少量文献报道仙灵骨葆在临床应用中的不良反应。~年间文献报道了4名女性患者在服用仙灵骨葆胶囊治疗骨质疏松症时引起肝功能异常,表现为ALT和AST升高,同时伴随黄疸等症状,停药或保肝治疗后肝脏功能均可以恢复正常[6-8]。另外,有报道仙灵骨葆的不良反应大多为对消化系统的影响,表现为食欲减退、便秘、口干、咽痛等[9-13]。

。。线粒体主要参与细胞内三羧酸循环、脂肪酸代谢、氧化磷酸化等多项重要的生理和生物化学过程。药物引起的线粒体损伤是药物性肝损伤的关键发病机制之一,主要包括包括线粒体膜通透性增加,膜电位下降,干扰线粒体能量合成,严重时导致线粒体膜破裂,细胞能量供应障碍,最终导致肝细胞坏死或凋亡[14]。

本研究使用大鼠原代肝脏细胞,通过肝脏细胞中ATP含量和线粒体膜电位等指标,比较仙灵骨葆两种不同提取方法对肝脏线粒体作用,初步探讨仙灵骨葆对肝脏有否损伤作用,为临床安全应用提供依据。

材料与方法

1.1药物、试剂、仪器

。。仙灵骨葆水提液、仙灵骨葆醇提液来自贵州同济堂制药有限公司,生产批号为723;ATP含量和细胞活力检测试剂盒(CllTitr-GloLuminscntCllViabilityAssay,购自Promga);Ttramthylrhodaminthylstrprchlorat(TMRE,SIGMA)、Carbonylcyanid3-chlorophnylhydrazon(CCCP)、牛血清白蛋白(BSA)、二甲基亚砜(DMSO)均购自Sigma;实验中所使用的其他化学试剂均为分析纯,购自于百灵威化学有限公司;实验中所使用的倒置荧光显微镜购自于日本尼康(Nikon,Ti-S);实验中所使用的酶标仪购自于美国Biotk(Biotk,Synrgy4)。

原代大鼠肝脏细胞分离中使用的鼠尾I型胶原,肝脏细胞种板和维持培养液均购自于Invitrogn。

。。仙灵骨葆水提液的制备:仙灵骨葆临床使用剂量为每次1.5g,每天2次共计3g,为获得远高于临床使用剂量的药物提取物,本实验选择1/10处方量(.6g)的仙灵骨葆按照下述方法操作:首先用8倍量的水98℃煎煮3h,6倍量的水煎煮2h,4倍量的水煎煮1h,合并煎液,直火蒸发浓缩至相对密度为1.06g·mL-1(30℃),水提液净重g。

。。仙灵骨葆醇提液的制备:同样取1/10处方量(.6g)的仙灵骨葆按照下述方法操作:分别用8倍量的75%乙醇78℃煎煮3h,6倍量的75%乙醇煎煮2h,4倍量的75%乙醇煎煮1h,合并煎液,先旋蒸回收乙醇后直火蒸发浓缩至相对密度1.08g·mL-1(30℃),无乙醇气味,醇提液净重.5g。

1.2大鼠原代肝细胞分离

。。本研究采用两步灌流法分离获得大鼠原代肝细胞,细胞活力大于85%。新鲜分离的肝细胞接种于I型胶原包被的细胞培养板上,37℃,5%CO2培养箱放置4h使细胞贴壁后进行后续实验。

1.3细胞中ATP含量检测

。。新鲜分离的原代肝细胞以5×/孔接种于96孔细胞培养板,细胞贴壁4h后更换肝细胞维持培养基,同时加入仙灵骨葆提取液,37℃,5%CO2培养箱培养24h后,按照使用说明,使用CllTitr-Glo?LuminscntCllViabilityAssay试剂盒检测细胞中ATP含量和肝细胞活力。

1.4线粒体形态观察和线粒体膜电位检测

?

。。新鲜分离的原代肝细胞按照1x/孔接种于6孔细胞培养板,细胞贴壁后,更换肝细胞维持培养基,同时加入仙灵骨葆提取液,37℃,5%CO2培养箱培养24h后,向阳性对照孔加入终浓度为20μm的阳性对照药物羰基氰化物间氯苯腙(CCCP),培养箱放置30min后,用含1μm线粒体膜电位阳离子探针(TMRE)的肝细胞维持培养基换液,继续孵育30min,弃去上清培养液,然后用0.2%BSA的PBS缓冲液洗涤2次。在倒置荧光显微镜下,观察肝细胞中线粒体形态并拍照。线粒体形态观察结束后,用胰酶将肝细胞消化重悬,并转移至透明底的黑色96孔培养板,在荧光酶标仪上检测TMRE荧光强度(激发:nm,发射:nm)。

1.5数据统计与分析

?

。。本研究使用GraphPadPrism和Excl进行数据分析和统计,统计方法为单因素方差分析,P0.05被认为具有显著差异。

结果

2.1仙灵骨葆醇提液和水提液对大鼠原代肝细胞ATP含量的影响

。。线粒体是真核生物中由双层高度特化的单位膜构成的细胞器,主要功能是通过氧化磷酸化作用合成ATP。因此药物导致肝脏细胞损伤时,肝细胞内ATP含量的变化可以有效地提示肝细胞内线粒体的状态以及肝细胞本身的活力。

首先将仙灵骨葆醇提液和水提液用培养基进行稀释,稀释倍数依次为:、、、和倍。将稀释后的仙灵骨葆提取液与大鼠原代肝细胞共孵育24h后,考察仙灵骨葆提取液对肝脏细胞ATP含量的影响。实验发现,在10倍稀释的醇提液和水提液给药24h后,肝细胞ATP含量分别下降到生理盐水组的6.5%和33.4%,提示仙灵骨葆在10倍稀释条件下,醇提液对肝细胞ATP含量的降低作用大于水提掖。而倍稀释的醇提液和水提液给药24h后分别下降到生理盐水组的细胞活力大于85%。新鲜分离的肝细胞接种于I型胶原66.7%和60.7%;当稀释倍数上升到、、倍的时候,包被的细胞培养板上,37℃,5%CO2培养箱放置4h使仙灵骨葆对细胞内ATP含量没有明显影响,且在高稀释细胞贴壁后进行后续实验。倍数时,肝脏细胞ATP含量有轻微的增加(图1)。

2.2仙灵骨葆醇提液和水提液对大鼠原代肝细胞线粒体膜电位的影响

。。线粒体依赖相互偶联的电子传递链进行氧化磷酸化作用的同时,通过泵出质子,从而在线粒体内膜两侧形成-mV的电势差,即线粒体膜电位。线粒体膜电位的正常维持在细胞能量合成,钙离子平衡,细胞凋亡等生理病理过程中均发挥着关键的作用。羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)是一种离子载体,可以导致线粒体电子传递链的解偶联,从而抑制线粒体膜电位的正常形成,因此在本研究中作为阳性对照。TMRE是一种亲脂性阳离子荧光探针,在进入细胞后,由于线粒体膜电位的存在,TMRE被线粒体摄取,从而在线粒体内富集,因此细胞中TMRE的荧光强度可以灵敏的反应线粒体的形态和功能。在检测肝脏细胞ATP含量的基础上,本研究进一步检测了仙灵骨葆提取液对肝脏细胞线粒体膜电位的影响(图2)。10倍稀释的仙灵骨葆醇提液和水提液分别将肝细胞线粒体膜电位下降到生理盐水组的23.25%和13.8%,明显降低了肝细胞线粒体膜电位,两种处理方式之间没有统计学差异。而在其他稀释倍数时,线粒体膜电位没有明显变化,且有轻微的升高趋势,这与ATP含量的变化一致。

2.3仙灵骨葆醇提液和水提液对大鼠原代肝细胞线粒体形态的影响

。。在正常生理状态下,TMRE荧光主要集中于线粒体中,并呈长丝状分布(图3Salin(40X))。而给予阳性对照解偶联剂CCCP,肝细胞线粒体内富集的TMRE量明显降低,长丝状特征消失(图3CCCP)。在给予仙灵骨葆含药血清24h后,镜下检查发现,仙灵骨葆醇提液在到倍稀释的情况下均对肝细胞线粒体的形态和TMRE荧光强度有很明显的作用(图3醇提液);而仙灵骨葆水提液仅在和10倍稀释的情况下,对线粒体形态和TMRE荧光强度有明显影响(图3水提液),在倍以上稀释时对肝细胞线粒体形态和TMRE荧光强度均无明显影响,结果提示醇提液对线粒体的损伤强于水提掖。

讨论

。。仙灵骨葆在动物和人体中的药代动力学研究还不是很清楚。秦子飞等[15]研究显示,大鼠给予仙灵骨葆60%乙醇提取液入血的成分主要来自于淫羊藿、续断、补骨脂和知母四味药物,主要包括13个原型成分和2个未知结构的代谢物(表1),而这些来自于仙灵骨葆的入血成分的药代动力学特征也不清楚。在秦子飞等人研究的基础上,通过文献调研,本研究收集整理了仙灵骨葆入血成分在仙灵骨葆各药材组分中的含量,然后依据淫羊藿等组分在仙灵骨葆胶囊中的含量比例,计算了各入血成分在仙灵骨葆胶囊中的含量,同时还收集整理了各入血成分在大鼠中的生物利用度数据(口服)(表1)。

。。仙灵骨葆在临床使用时,一般为每次1.5g,每日2次共计3g。本研究使用十分之一处方的仙灵骨葆共计.6g,分别进行水提和醇提处理,水提的最终体积为mL,醇提的最终体积为mL,是水提的1.5倍,两者密度相近,分别为1.06g·mL-1和1.08g·mL-1。由文献可知,对仙灵骨葆进行水提和醇提的操作,可以有效地回收仙灵骨葆各成分,回收率可以达到50~95%,醇提取的回收率高于水提取方式[35]。因此,按照表1中仙灵骨葆各入血成分的生物利用度,本研究使用如下的公式,比较本研究所使用的仙灵骨葆提取液中已知成分(文献报道的)含量和临床患者血药浓度之间可能的差异。计算发现,仙灵骨葆提取液中已知成分的有效浓度可能是临床平均血药浓度的倍以上。

。。线粒体损伤是药物性肝损伤发生发展的关键机制之一。本研究对仙灵骨葆醇提液和水提液对线粒体的作用进行了初步评价和比较。研究发现,仙灵骨葆提取液对肝细胞线粒体功能的影响呈明显的剂量相关性。尤其是在更接近临床使用方式的仙灵骨葆水提液中,只有10倍稀释的仙灵骨葆水提液对肝细胞ATP含量,线粒体膜电位和形态有明显影响,倍稀释则仅对线粒体形态有影响,而~稀释的仙灵骨葆水提液对肝细胞线粒体功能没有明显影响(图1~3)。按照前述公式的计算,倍稀释的仙灵骨葆水提液中入血成分浓度可能是临床患者血药浓度的5倍以上,而10倍稀释的仙灵骨葆水提液则可能是临床用量的50倍以上,提示目前临床上仙灵骨葆的用药方案具有一定的安全性,在后续的工作中尚需要进一步考察仙灵骨葆血药浓度和肝脏组织内分布的差异,以及肝脏代谢在其中可能的影响,综合多方面数据和信息,深入评价仙灵骨葆临床用药的安全性。

。。本研究进一步发现,从细胞内ATP含量和肝细胞线粒体形态两个指标来看,仙灵骨葆醇提液对线粒体功能的影响明显强于仙灵骨葆水提液,同样呈明显的剂量相关性(图1~3)。两个因素可能增强了仙灵骨葆醇提液的作用:①本研究使用75%的乙醇对仙灵骨葆进行提取,悬蒸浓缩至无醇味,并未检测残余的乙醇含量,残余的乙醇可能加重了线粒体损伤[36];②75%乙醇提取可能提高了仙灵骨葆各成分的回收率,醇提液中的有效成分浓度可能较高。另外,仙灵骨葆醇提液较强的线粒体损伤作用提示,在仙灵骨葆临床应用时,需要避免饮酒,而长期饮酒或酗酒患者需要密切

------分隔线----------------------------
Copyright (c) @2012 - 2020



提醒您:本站信息仅供参考 不能做为诊断及医疗的依据 本站如有转载或引用文章涉及版权问题 请速与我们联系